RISC関連のAGOメンバーの進化

AGOタンパク質ファミリーは、RISCを介した遺伝子調節において中心的な役割を果たしています。 AGOは、主に4つの特徴的なドメインを含む:N末端、PAZ(小RNA結合を担う)、MidおよびC末端PIWI(触媒活性を付与する)ドメイン(補足図S1およびS2)1 8,1 9。 多くの非コードRnaは、それらの基質であり、miRNA、siRNAおよびPiwi相互作用Rna(piRNA)を含む2 0。 小Rnaは、配列相補性を介してAgoをそれらの特異的標的に誘導し、これは典型的には、主に転写後阻害またはmRNA分解によって標的のサイレンシングを引

AGO2とその同族体は、脊索動物、節足動物、線虫動物およびPlatyhelminthesで同定されており、AGOsの系統樹が構築されました(図。 図1aおよび補足図1Bおよび補足図1b。 S3)。 それらのRNA結合特性または機能に応じて、これらのAgoは、(i)多機能Ago;(I I)siRNA関連Ago;および(III)piRNA関連Agoの3つのクラスに分けられた。 クラスi Agoは、全てのヒトAgoがsiRNAおよびmiRNAの両方と結合する脊索動物AGO1−4を含む。 図に示すように。 図1Aに示すように、脊索動物AGO1-4は、AGO2およびAGO1/3/4の二つのサブクラスを含む。 AGO2タンパク質のみがエンドヌクレアーゼとして機能し、完全に相補的なsirnaまたはmirnaと塩基対の領域内でmRNAを切断する。 AGO1/3/4は、Ago21、22をスライスし、バイパス機構を介して乗客のストランドを削除しています。 クラスII AGOsは節足動物(ショウジョウバエAGO2)および線虫AGOs(TAG-76/ERGO1/WAGO1/YQ53/NRDE3)を含むsiRNAに特異的に結合する。 節足動物および線虫のAGOsは、哺乳類のAGOsの単系統群と比較して進化的に複雑である(Fig. 図1aおよび補足図1Bおよび補足図1b。 S3)。 DROSOPHILA AGO2は、RISC複合体の一部として、Drosophila胚におけるsiRNA二重鎖の巻き戻しおよびその後のsiRNAのRISCへの組み立てに必要とされる。 ショウジョウバエAGO2は、植物/Chordata AGOsと密接な進化関係を共有しました(補足図。 S3)。 AGO1はショウジョウバエのembryos23の有効なRNAiのために必要ではないが、Uniprotでunannotated図でunannotated。 系統樹およびPfam/SMARTベースのドメイン構造は、TAG−7 6(Caenorhabditis elegans、c.elegans)が哺乳動物Agosと適度な類似性を有することを示している(補足図1A)。 S2)。 残念なことに、その生物学的機能はまだ不明であるが、他の線虫タンパク質はRNAi経路に関与している。 ERO-1はAGOとして機能し、内因性のRnai経路で機能する24。 WAGO1はワームに特異的な遺伝子であり、特定の遺伝子、トランスポゾン、偽遺伝子、および不可解な遺伝子座25を沈黙させる。 PAZおよびPIWIドメインを有する非特徴的なYQ5 3を補足図に示す。 S2は、内因性および外因性Rnai18の可能な機能を有する18。 別の核A GOタンパク質、NRDE3は、siRNAに結合し、核Rnaiに必要とされ、したがって、遺伝子発現を調節するために異なる細胞区画に特定のクラスの小さな調節Rnaを輸送する26。 クラスIII AGOsは脊索動物PIWIL1-4、節足動物AGO3/AUB/PIWI/SIWIおよびPlatyhelminthes PIWIL/PIWI1/PIWI2で構成されています。 PIWIファミリーのメンバーであるPIWIL1-4は、PIRNAに結合し、生殖系列細胞でのみ発現されるが、他のAgoはほとんどの組織で遍在的に発現される27。 また、補足図。 S3は、他の節足動物AGO2関連タンパク質が脊索動物PIWIL1-4のサブクラードに近いことを示しており、それらはトランスポゾン転写産物を切断し、ショウジョウバエ卵巣生殖細胞における生殖系列ゲノムを保護するためにトランスポゾン転写を抑制するためにPiwiを指示するpirnaによって指示されている。 PIWIタンパク質ファミリー(PIWIL、PIWI1およびPIWI2)のメンバーは、Platyhelminthes(Dugesia japonicaおよびSchmidtea mediterranea)でも同定されている。 それらは動物AGOsのものと同様のドメインを有し、幹細胞機能およびpiRNA生物形成に必要とされ得る(補足図S2およびS3)28,29。

これまでの研究では、植物中のAGOsの三つのクレードが決定されています30。 例えば、Arabidopsis thaliana(A.thaliana)は、(i)AGO1、AGO5、AGO1 0;(I I)AGO2、AGO3、AGO7;および(III)AGO4、AGO6、AGO8、AGO9の3つのクレード内で、その1 0のメンバーの等しい分布を示す。 これらの結果と一致して、我々の分析は三つの主要なクレードを示し、これらの植物AGOsは、人工的にその機能に基づいて三つのクラスにグループ化された:(I)多機能AGOs;(II)siRNA関連AGOs;および(III)相補的な機能AGOs。 しかしながら、タンパク質配列同一性に基づくBLASTスコアは、より正確な分類を提供しない(図1 0A)。 図1aおよび補足図1Bおよび補足図1b。 S3)。 クラスi Agoは、AGO1/AGO5/AGO1 0(a.thaliana)およびAGO1A/AGO1B/AGO1C/AGO1D/AGO1 1/AGO1 2/AGO1 3/AGO1 4/AGO1 7/AGO1 8/PNH1/MEL1(Oryza sativa、O.sativa)である。 AGO1はmiRNAおよびsiRNA経路に作用し、AGO10は少なくともいくつかの組織においてこれらの経路に関与している可能性があります。ago5は核と細胞質の両方に局在し、small Rnaに結合し、RNAを介した転写後遺伝子サイレンシングを調節しています31。 PNH1(O. サティバ)は、おそらくシュート頂端分裂組織と葉adaxial細胞の仕様とRNAサイレンシング経路32、33の形成に影響を与えます。 MEL1はおそらく小さなRNA関連遺伝子サイレンシングを仲介し、その機能はArabidopsis33で別のAGOによって実行される可能性があります。 クラスII AGOsはAGO2/AGO3/AGO7(A.thaliana)およびAGO2/AGO3/AGO7(O.sativa)を含んでいます。 AGO7は、葉の発達タイミングに関与するRDR6/SGS3/DCL4/AGO7トランス作用siRNA経路に作用する。 AGO2/3はPIWIドメインのDDHモチーフを欠いており、おそらく同様の活動を持っている;とAGO2/AGO3変異体は発達上の欠陥を示していません。 クラスIII AGOsはAGO4/AGO6/AGO8/AGO9(A.thaliana)およびAGO4A/AGO4B/AGO15/AGO16(O.sativa)を含んでいます。 これらのAGOsは相補的な生物学的機能を有する。 AGO4は、異なる核複合体と異なる経路で共有されている可能性がある34。 AGO6はヘテロクロマチンsiRNAおよび転写遺伝子サイレンシング経路に必要であり、AGO6活性はAGO4の活性と部分的に冗長である。 AGO8/9(A.thaliana)mrnaは、異なる組織分布を持っており、それらの変異体は、植物の表現型に影響を与えません。 配列同一性に基づいて、クラスiメンバーの明確なグループ(橙色)が存在するが、クラスIIメンバー(緑色)とクラスIIIメンバー(暗緑色)の間に重複領域が存在する(図 1A)。 アタゴスは何十年も研究されてきましたが、多くの疑問が残っています。 OsAGOsは、図に示すように多くのアイソフォームが同定されたため、より高い多様性および遺伝子重複を有するように見える。 図1aおよび補足図1Bおよび補足図1b。 S3…

PIWIドメインを含む単一のAGOは、Protista Giardia intestinalis(Giardia lamblia)ゲノムで同定され、RNAi経路を介して各寄生虫の表面上の変異特異的表面タンパク質(VSP)発現を調節する(補足図S2およびS3)35。 驚くべきことに、酵母からPAZとPiwiドメインを持つ単一のAGO1は、真菌で発見され、密接に植物の第三のクレードに位置していた(補足イチジクS2とS3)。 それは配列特異的なDNA結合活性を有する可能性があり、RISCにおけるその詳細な役割は詳細に探求される可能性がある。RISC関連ダイサーメンバーの進化

RNAiプロセスは、RNA分子とRISCとの間の相互作用から生じる。

RISC関連ダイサーメンバーの進化

RNAiプロセスは、RNA分子とRISC ダイサーは、dsRNA分子をアンカーし、それを切断して、Rnaiプロセスにおける一次RNA認識および処理酵素としての短いdsRNAを生成する。 ダイサーはRNase IIIファミリーのメンバーであり、進化において高度に保存されている。 配列解析により,各種のダイサーは同様のドメインを有することが示された。 ほとんどの種では、ダイサーのN末端はRNAヘリカーゼドメインであり、続いてPAZドメインである(補足図1)。 S1)。 ダイサーのC末端には2つのRNase IIIドメインとdsRNA結合ドメインがある36。

ダイサーは真核生物に広く存在する。 ダイサー科の現在の系統樹は、動物、植物および真菌においてその独立した多様化を示している(Fig. 図1Bおよび補足図。 S4)。 動物Agosの系統樹とは異なり,動物ダイサーの単系統群は脊索動物,節足動物および線虫を含み,一つのクラスは機能的に生成された:多機能ダイサーであった。 これらのダイサーは、ヘアピンまたはdsRNAを認識し、それらを成熟したmiRNA-miRNA*/siRNA二重鎖に処理する二重機能を有する。 これは、節足動物ダイサー(ショウジョウバエDCR1)は、miRNAの生物発生のために必要であり、UniProtで未検討のショウジョウバエダイサーパラローグDCR2は、sirnaを生成するためであ 線虫ダイサー(c.elegans DCR1)のヘリカーゼモチーフは、siRNAには必要であるが、miRNAには必要ではない、37、38、39、40を処理する。 ピルナ処理に必要なダイサーは未確認のままである。 付加的に構築された脊索サブクレードは、DDX5 8、DHX5 8、IFIH1、FANCMおよびRNCを含む(図1 0A)。 図1Bおよび補足図。 S4)。 それらはすべてヘリカーゼ活性を有するが、DDX58およびDHX58はDNAに結合し、IFIH1およびFANCMはRNA結合親和性を有する。 機能的には、それらはRISC様複合体に関与し、外因性ストレスに応答する可能性がある。 RNCはdsRNA特異的RNase IIIをコードしている。

植物には四つのダイサー(DCL1-4)がある38。 補足図。 S4は、dcl1、DCL2、DCL3およびDCL4の4つのサブクラードを含む植物ダイサーの単系統群を示す。 植物の小さなRnaの成熟タイプに基づいて、これらのダイサーは、二つのクラスにグループ化されました:(I)多機能ダイサー(DCL1); および(I I)siRNA関連ダイサー(DCL2−4)。 DCL1は、miRNA/siRNA前駆体を処理するためにRISC形成に関与する。 Atdcl2-4はsirnaを生成し、ウイルス防御および天然のcis作用アンチセンス転写物、クロマチン修飾ガイダンスまたは栄養相変化調節からのsirnaの産生に関与している39、40、41。 RTL3(O.sativa)はDCL1サブクラードとRNase IIIファミリーに属し、miRNA/siRNA経路が関与している可能性があることを示唆している。 さらに,より多くのダイサーアイソフォームがOに見出された。 サティバは、遺伝子重複イベントがイネダイサーの進化の間に発生している可能性があることを示しています。 植物クレードは、dsRNAを切断し、小さなRnaを産生するリボヌクレアーゼであるRTL3(A.thaliana)とRTL2(A.thalianaとO.sativa)を含むアウトグループに位置しています。真菌(子嚢菌)ダイサーは、(i)DCL1、DCR1(Schizosaccharomyces pombe,S.pombe);および(I I)DCL2(図1)のブートストラップ値によって支持される2つのサブクラードを示す。</p><p>真菌(子嚢菌)ダイサーは、6 4の 図1Bおよび補足図。 S4)。 栄養細胞では、dcl2はsiRNAの生物形成過程における主要なダイサー酵素であるが、DCL1は冗長な役割を有する42。 しかし、dcl1のみが特異的に発現され、meiosis43中に減数分裂サイレンシングのために必要とされます。 SiRNA成熟プロセスにおいて、dsRNA前駆体は、動物において類似の正準ダイサーのドメインを有するDCR1によって処理される。 DCR1(S.pombe)は、分裂酵母におけるダイサー相同体である。 MPH1は、dna損傷応答に関連するATP依存性DNAヘリカーゼであり、ゲノム統合性を維持する44。 酵母MFH2は、DNA結合およびDNAヘリカーゼ活性を有する。 他のクレードは、主に、RNaseをコードし、Rnaを切断する細菌RNCs(Actinobacteria、Aquificae、Firmicutes、Proteobacteria、Tenericutes、およびThermotogae)に由来する(図10B)。 図1Bおよび補足図。 S4)。RISC関連TRBPおよびPACTメンバーの進化

TRBPはHIV-1遺伝子発現45に関与しており、miRNAとIFN-PKR経路のHIV-1感染への応答46をリンクしている可能性があります。

TRBPはHIV-1遺伝子発現45に関与している可能性があります。 脊椎動物では、TRBPは、プロテインキナーゼR(PKR)活性化タンパク質またはPACT4 6,4 7のパラローグである。 それらは、PKRを阻害剤(TRBP)または活性化剤(PACT)として調節する。 TRBPおよび/または三つのDRSMドメイン(dsrnaに結合し、タンパク質-タンパク質相互作用を仲介する)とのPACTのRISC関連の生物学的機能は、補足図に示されています。 S2は、ダイサーへの基質の補充、未成熟miRNAのダイサー媒介処理の促進、ダイサー産物の除去、およびどのタイプのdsRNAがAgos上にロードされるかの制御である1 2、1 3。

私たちの系統樹では、TRBPs/PACTsはChordataにのみ示されています(図。 図1C、Dおよび補足図S5およびS6)。 それ以外の場合は、ショウジョウバエR2D2およびC. elegans RDE-4、RNAi処理の両方の既知の参加者は、遠くTRBP/PACTに関連しており、TRBP/PACTの脊索クレードでは出現しません。 Loquaciousは昆虫で同定されているが、それらは配列同一性が低く、UniProtでは未検討のエントリのために考慮されていない(Fig. 1C、D)。 他の進化的に関連するRNA/DNA結合遺伝子は、DSRAD(脊索動物)、STAU1/2/STAUH(脊索動物、軟体動物および節足動物)、ILF3(脊索動物)、STRBP(脊索動物)、RED1/2(脊索動物)およびRNC(ChloroflexiおよびProteobacteria) DsradはRNA編集に関与し、risc48へのmiRNAのロードを容易にする。 脊索動物STAU1/2/STAUHは、mRNAの輸送または分布において機能するようである49,50、およびmiRNA前駆体と同様に、Exportin-5は、核からStaufen-dsRNA複合体を輸送する51。 脊索動物ILF3はRNAに結合し、環状Rna(circRNA)の生物形成において機能する。 脊索動物STRBPは、結合dsDNA/RNAを介して精子形成と精子機能を調節します。 脊索酸RED1は、遺伝子発現および機能に影響を与えるためにA-to-I RNA編集を触媒する。 アデノシンデアミナーゼ活性およびdsRNA/ssRNA結合親和性を有する脊索動物RED2は、他のADAR酵素の標的への結合を防止し、これらの酵素の効率を低下させる。 クロロフレキシおよびプロテオバクテリアのrncはRNase IIIファミリーに属している。 意外なことに、DRB2(O.sativa)およびIIV6-340R(無脊椎動物虹色ウイルス6)は、それぞれ、協定の系統樹における脊索dsradおよび細菌Rncのクレードに位置していた(図 図1Dおよび補足図。 S6)。 それらはおそらく植物またはその宿主のRnaに結合し、切断するが、それらのRISC関連の機能はまだ不明である。

RISC関連GW182メンバーの進化

動物で同定されたGW182は、riscの重要な構成要素であり、miRNAを介した遺伝子調節のためのN末端領域を介してAGO1のPIWIドメ S1)および配列の長さ、保存および構成の高い多様性を表わします。 本研究では、GW182とそのオルソログの全長配列は、以前の結果と一致していた信頼性の高い系統発生再構成のために使用されました(補足図。 7月17日にfaとなった。 結果は、哺乳類TNRC6Cを表すと非脊索動物GW182遺伝子のオルソログから分岐脊索動物遺伝子ファミリーの創設メンバーであることを示しています。

私たちの研究では、ヒト、マウス、ハエを含む限られた数のGW182が同定され、特徴付けられました(図。 図1Eおよび補足図。 S7)。 GW182mRNA/タンパク質のさらなるデータベースBLAST検索分析は、線虫でも、非常に確信した配列の類似性と生物学的機能を持つ追加の相同体を示しませんでした。 代わりに、2つの機能的類似体、AIN-1とAIN-2は、c.elegansのゲノムにコードされています。 線虫にコードされる遺伝子の半分以上がユニークであるため、観察は驚くべきことではありません52。

主要なRISCメンバーの遺伝子重複解析

遺伝子重複は、表現型の多様性、人間の病気の原因、進化の重要な原動力です。

我々の研究では、主要なRISCメンバーの遺伝子重複イベントを定量化しました。 AGOsの木で同定された51の遺伝子重複があった(補足図。 S8)。 動物AGOsのクラスI、IIおよびIIIは、それぞれ6、4および14の遺伝子重複を含んでいた。 植物AGOsのクラスI、IIおよびIIIは、それぞれ13、3および5遺伝子重複を含んでいた。 ダイサーの木では、61の遺伝子重複が決定された(補足図。 S9)。 このクラスの動物ダイサーのうち、4つの遺伝子重複が脊索から生じた。 植物ダイサーの二つのクラスでは、クラスIIのみが6つの遺伝子重複を持っていた。 TRBP/PACT/GW182については、68/27/10の遺伝子重複があり、それらの密接に関連する遺伝子重複の数はそれぞれ1、3および2であった(補足図10-12)。 これらの結果は,Agosとダイサーにおける多くの遺伝子重複が進化の多様性の主な原因であることを示唆している。

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