L’EGFR-TKIs sono più specifici di efficacia clinica, rispetto allo standard chemotherapy19, quando somministrato come seconda o terza linea di terapia per NSCLC avanzato. Tuttavia, è stato dimostrato che il 60% dei pazienti che hanno ricevuto un trattamento con TKI per 6-10 mesi avrebbe eventualmente sviluppato resistenza alla TKI. La resistenza ai farmaci è stata classificata in resistenza primaria e secondaria (resistenza acquisita). Di solito i pazienti che hanno ricevuto TKIS per circa 2 settimane mostrerebbero un miglioramento dei sintomi clinici, come la riduzione della massa tumorale in radiografia e la valutazione dell’effetto, inclusa la remissione completa (CR), la remissione parziale (PR) o la malattia stabile (SD) in un determinato momento. Se i tumori non mostrano alcuna risposta apparente al TKIS durante il trattamento iniziale, si chiama resistenza primaria. La resistenza secondaria (resistenza acquisita) è molto diversa nella definizione; un effetto terapeutico apparentemente benefico può essere osservato dopo aver iniziato a prendere TKIs, ma dopo 6-10 mesi di trattamento, il tumore non può più essere soppresso e può persino aumentare di dimensioni, con conseguente miglioramento del trattamento. Attualmente sono stati identificati molti meccanismi di resistenza ai TKI, ma i meccanismi di resistenza primaria non sono chiari. Il meccanismo di resistenza primaria meglio descritto è una mutazione nel KRAS oncogene che è presente nel 20-30% dei pazienti affetti da cancro del polmone. Il principale meccanismo di resistenza acquisita è stato segnalato per essere la mutazione T790M sull’esone 20 sul gene20, 21 di EGFR. Altri meccanismi includono l’amplificazione del gene met20,21, la mutazione PIK3CA21, 22,la mutazione BRAF23, la transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT)21 e la trasformazione del carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) 20, 21.

È stato riportato da due gruppi che una mutazione secondaria da treonina a metionina al codone 790 (T790M) del gene EGFR è correlata alla resistenza acquisita a gefitinib ed erlotinib (TKIS di prima generazione)24,25. La modellazione della struttura cristallina ha dimostrato che il residuo T790 si trova nella tasca di legame ATP della regione catalitica di EGFR e sembra essere fondamentale per il legame di erlotinib e gefitinib24. La sostituzione della treonina al codone 790 con un residuo più ingombrante, come la metionina, comporterebbe un ostacolo sterico al legame di questi due farmaci. Una mutazione secondaria di T790M è stata identificata in un tumore24 e in tre di sei tumori25 con resistenza acquisita a gefitinib. Nel nostro studio, abbiamo trovato che il tasso di mutazione primario di T790M era 1.6% (3/177) e il tasso di mutazione secondario era 42.8% (15/35). Questo cambiamento supporta ulteriormente che la mutazione T790M può essere un giocatore importante durante lo sviluppo della resistenza acquisita.

I metodi di rilevamento per le mutazioni T790M includevano il sequenziamento diretto (DS), il sistema di mutazione refrattaria all’amplificazione (ARMS), la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), la PCR digitale a goccia (ddPCR) e il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Per il rilevamento di T790M, questi metodi di rilevamento hanno i loro vantaggi e svantaggi: 1. Rispetto a ddPCR e NGS, il processo di rilevamento di braccia e Super-BRACCIA è relativamente semplice e veloce e il costo è inferiore, ma la sensibilità è leggermente inferiore. 2. Rispetto alle ARMI ed alle Super-ARMI, la sensibilità del ddPCR e del NGS è leggermente più alta, ma il processo di rilevazione è complesso ed il costo è più alto. Il sequenziamento diretto è un metodo standard per il rilevamento di mutazioni T790M in Cina, ma il processo è noioso, richiede tempo e la sensibilità è più bassa26. La maggior parte delle mutazioni sono mutazioni somatiche, cellule mutanti che di solito sono mescolate con cellule di tipo selvaggio; pertanto, il DNA estratto ha spesso una grande quantità di DNA di tipo selvaggio, quindi la rilevazione della mutazione sulle cellule somatiche richiede una maggiore specificità. Allo stato attuale, il sequenziamento diretto è limitato e non può soddisfare le esigenze cliniche. Il Super ARMS, che abbiamo utilizzato in questa ricerca, è una tecnologia aggiornata basata sulle ARMI tradizionali. Abbiamo aggiunto una struttura auto-anellata sul Super ARMS primer che può essere aperta e delimitata con una sequenza target durante la fase di ricottura, per ottenere la rilevazione di una certa mutazione. Questa struttura ha rafforzato la capacità distintiva del primer e quindi migliorato la specificità e la sensibilità del test. Nel nostro studio, la sensibilità, la specificità, il PPV, il NPV e la precisione dei Super ARM erano 100.0%, 99.4%, 94.7%, 100.0% e 99,5%, rispettivamente. La sua sensibilità era superiore alle ARMI tradizionali (48,2–63,6)26,27 e altri parametri erano sostanzialmente coerenti con studi precedenti26, 27. Ci sono due vantaggi di Super ARMS rispetto alle braccia. Innanzitutto, la sensibilità di rilevamento di Super ARMS è stata notevolmente migliorata (0.2% rispetto alla sensibilità delle BRACCIA dell ‘ 1%), consentendo di rilevare un maggior numero di pazienti con mutazioni EGFR. In secondo luogo, rispetto alle BRACCIA, Super ARMS è particolarmente adatto per campioni di plasma a causa della sua maggiore sensibilità. La PCR digitale (dPCR) è un metodo di rilevamento delle mutazioni genetiche altamente sensibile che si basa sulla compartimentazione e sull’amplificazione di singole molecole di DNA. La quantificazione dei compartimenti con fluorescenza endpoint dopo il processo PCR rivela il numero di copie del DNA bersaglio. Droplet digital PCR (ddPCR) è una tale tecnologia dPCR che si basa sulla compartimentazione del DNA in goccioline. Nel ddPCR, i singoli frammenti di DNA sono compartimentati in più di un milione di goccioline, che vengono poi amplificate in parallelo. ddPCR è una tecnologia promettente come la sua velocità, costo, e facilità d’uso sono simili ad altri saggi basati su PCR, ma la sensibilità e la natura quantitativa di questo saggio offre applicazioni cliniche più ampie. Attualmente, ddPCR si è dimostrato un metodo efficiente e affidabile per il rilevamento della mutazione T790M28,29. Pertanto, tutti i campioni di Super ARMS sono stati verificati nuovamente da ddPCR nel nostro studio. In particolare, un campione è stato giudicato come un falso positivo quando, rispetto al risultato ddPCR. Due ragioni possono spiegare questo problema. In primo luogo, il rilevamento del risultato era vicino al valore critico, e quindi è stato giudicato erroneamente come positivo. Inoltre, la contaminazione da PCR può anche portare a falsi positivi. Nonostante un caso falso positivo, la tecnica può essere ulteriormente migliorata e intensificata.

Il tasso di mutazione dell’EGFR era 30.1% (64/212)tra i pazienti con NSCLC, che era nella gamma degli studi precedenti (30-50%) 3,30,31,32. Allo stesso modo, donne, mai fumatori, metastasi cerebrali e adenocarcinoma sono stati associati a un più alto tasso di mutazioni EGFR in questo studio. In parte, abbiamo appena studiato la prevalenza delle mutazioni EGFR-T790M nella provincia dello Yunnan, nel sud-ovest della Cina.

Il tasso di mutazione di T790M era dell ‘ 8,4% tra i pazienti con NSCLC, che era nell’intervallo dei rapporti precedenti33,34. Nei campioni di plasma non-TKI, donne, mai fumatori e adenocarcinoma non sono stati significativamente correlati con un più alto tasso di mutazione T790M in pazienti NSCLC in questo studio. Questo era simile ad altri studi precedenti34, 35. La metastasi cerebrale è stata correlata con un più alto tasso di mutazione T790M nei pazienti NSCLC. Ciò è stato analogo anche ad altre relazioni34, 35. Tuttavia, il tasso di mutazione di T790M era 0.0% (0/31) nello stadio di TNM (Ia-IIIa). In particolare, era inferiore al tasso di mutazione T790M nello stadio TNM (IIIb-IV), che era del 9,9% (18/181); nessuna associazione significativa è stata trovata nello stadio TNM. Sebbene ciò non corrisponda ad altri studi precedenti, la sua tendenza è stata pronunciata36. Ci sono tre spiegazioni possono meglio spiegare questa controversia. In primo luogo, abbiamo raccolto solo i dati disponibili in questo studio, che può portare a un pregiudizio di selezione. In secondo luogo, il numero di campioni non erano sufficienti a riflettere la relazione tra le mutazioni T790M e lo stadio TNM di NSCLC nella provincia dello Yunnan. Infine, la biopsia è ancora il gold standard per rilevare le mutazioni di T790M. Tuttavia, poiché il plasma è stato utilizzato per rilevare la mutazione di T790M in questo studio, può anche portare a pregiudizi. Nei campioni di plasma post-TKI, donne, mai fumatrici e adenocarcinoma non sono stati significativamente associati al più alto tasso di mutazione T790M nei pazienti NSCLC in questo studio. Questo era simile ad altri studi precedenti34. Le metastasi cerebrali erano correlate con un più alto tasso di mutazioni di T790M, che era in buon accordo con altri riferimenti35. Il tasso di mutazione T790M è stato del 42,8% (15/35) nello stadio TNM (IIIb-IV). Pertanto, indipendentemente dallo stato del trattamento con TKI, la metastasi cerebrale è stata correlata con un più alto tasso di pazienti NSCLC.

Nei campioni di plasma non-TKI, il tasso di mutazione T790M era 1.6% (3/177). Questo era inferiore rispetto ad altri studi precedenti che utilizzavano il metodo investigativo delle arme35, 37. Pertanto, sia i Super AMRS che i BRACCI erano limitati per la rilevazione della mutazione primaria T790M. Nei campioni di plasma post-TKI, il tasso di mutazione di T790M era del 42,8%, che era coerente con altri rapporti precedenti35, 37 e molto più alto rispetto ai campioni di plasma non-TKI (p < 0,001). Per dimostrare ulteriormente che il principale meccanismo di resistenza acquisita è la mutazione secondaria T790M. Abbiamo anche analizzato la relazione tra il tasso di mutazione T790M e la durata del TKI per esplorare il meccanismo della resistenza acquisita. Abbiamo scoperto che la durata di TKI da 6 a 10 mesi (p < 0.01) e >10 mesi (p = 0.01) erano associati a un tasso di mutazione T790M più alto. È stato anche confermato che molti pazienti che hanno scelto di utilizzare TKI per almeno 6 mesi avrebbero sviluppato resistenza e il 60-70% della resistenza TKI era correlato alla mutazione T790M38. Allo stesso modo, il tasso di mutazione T790M era del 66,6% (8/12) nella durata del TKI (6-10 mesi). Questo era inferiore alla durata del TKI (>10 mesi), 75% (9/12), che era coerente con altre relazioni37,38.

I nostri studi precedenti hanno rilevato che il tasso di mutazioni EGFR nella città di Xuanwei era diverso da quello delle popolazioni generali3, il che ha motivato la nostra esplorazione sul fatto che la mutazione T790M abbia specificità regionale nella città di Xuanwu. Tuttavia, abbiamo scoperto che i pazienti NSCLC nella città di Xuanwei avevano un tasso di mutazione T790M inferiore rispetto alla città non Xuanwei nel nostro studio. Inoltre, nessuna associazione significativa è stata trovata nell’origine di Xuanwei. Pertanto, altri fattori possono svolgere un ruolo importante nella progressione e nello sviluppo del cancro ai polmoni ad eccezione dei fattori genetici nella città di Xuanwu. Dal momento che il nostro studio reclutato pazienti in un unico centro e il numero di campioni di pazienti Xuanwei NSCLC non erano abbastanza grandi, che è portare il fatto che il nostro campione non poteva riflettere meglio il tasso di mutazioni EGFR-T790M in città Xuanwei. Ma sono previsti ulteriori studi.

I pazienti con NSCLC mutante EGFR traggono un significativo beneficio terapeutico da TKI. Sfortunatamente, la resistenza acquisita è una conseguenza inevitabile di questa strategia di trattamento. Di conseguenza, è particolarmente importante trovare una strategia di trattamento che superi la resistenza dei TKI derivanti dalla mutazione T790M. La strategia di trattamento per la resistenza ai farmaci nella fase attuale sono i seguenti: 1. Ritardo acquisito resistenza a TKIs: La valutazione dei pazienti con progressione sulla terapia TKIs di prima linea dipende principalmente da RECIST (Criteri di valutazione della risposta nei tumori solidi), ma questo non fornisce linee guida per il ritiro del farmaco. Alcuni pazienti possono avere progressione di RECIST basata sulle misure del tumore ma mostrano il beneficio clinico continuato dalla terapia. Molti pazienti asintomatici possono ritardare un cambiamento nella terapia per 2-3 mesi39. Due studi hanno riferito che alcuni pazienti NSCLC erano sensibili agli inibitori dell’EGFR e quando i TKI venivano interrotti ciò avrebbe portato la progressione del cancro ad accelerata40,41. Di conseguenza, è ancora utile continuare a prendere TKIs per molti pazienti, anche dopo che la resistenza TKI si sviluppa. Tuttavia, deve essere chiaro quando il TKI deve essere interrotto: (1) Nuove lesioni metastatiche (metastasi cerebrali non incluse, a causa della barriera emato-encefalica), in particolare l’emergere di una vasta gamma di metastasi. (2) I sintomi correlati alla malattia sono aumentati in modo significativo. (3) Il tumore cresce rapidamente. 2. TKIS di seconda generazione: Afatinib è un inibitore doppio di EGFR / HER2 che ora FDA-è approvato per il trattamento di prima linea dei cancri polmonari con le mutazioni di EGFR L858R o le eliminazioni dell’esone 19. NCCN ha anche suggerito di utilizzare afatinib per sostituire i TKI di prima generazione dopo che inducono resistenza ai farmaci42. 3. TKI di terza generazione: L’edizione 2016 del NCCN, NSCLC clinical practice guidelines ha raccomandato tagrisso (AZD9291) come trattamento di seconda linea per i pazienti che hanno la mutazione T790M o hanno ricevuto TKI di prima generazione che ha portato alla resistenza ai farmaci15. 4. Inibizione MET: l’amplificazione MET viene rilevata in circa il 5% dei tumori con resistenza acquisita a TKIs21. Pertanto, le terapie mirate alla MET possono essere una strategia efficace nei tumori amplificati dalla met43. 5. Terapia immunitaria: Secondo uno studio clinico multicentrico, la prima generazione di anticorpi monoclonali TKI + PD-1 può raggiungere il 19% di RR e PFS in 24 settimane44.

Nel complesso, è possibile rilevare mutazioni T790M derivate dal tumore nel gene EGFR utilizzando cfDNA da pazienti con NSCLC utilizzando Super ARMS. Il tasso delle mutazioni T790M nei pazienti NSCLC della città di Xuanwei non ha mostrato alcuna differenza significativa rispetto alle altre popolazioni asiatiche. I nostri studi hanno dimostrato che i pazienti NSCLC con metastasi cerebrali, storia di TKI di prima generazione e durata di TKI > 6 mesi, erano in relazione con un tasso di mutazione T790M più alto. Inoltre, Super ARMS è stato utilizzato per rilevare il tasso di mutazione T790M, che è una delle più importanti scoperte recenti nell’oncologia NSCLC. Considerando la limitazione del nostro studio, ulteriori ricerche dovrebbero esplorare una grande dimensione del campione da più centri nella provincia dello Yunnan per renderlo più rappresentativo per la popolazione complessiva. Attraverso l’analisi del significato e della produttività clinica della tecnologia di rilevamento per la mutazione T790M, abbiamo scoperto che la tecnologia di rilevamento per la mutazione T790M potrebbe aiutare i pazienti a decidere una strategia di trattamento, aiutarli a risparmiare sui costi di trattamento e ottenere una prognosi migliore e, forse più importante, fornire una guida significativa per il trattamento della resistenza ai farmaci nei pazienti con mutazione del gene T790M.

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