Campioni che hanno un valore di assorbanza che non rientra nell’intervallo della curva standard

Per ottenere un risultato accurato, questi campioni devono essere diluiti o concentrati prima di procedere con la colorazione ELISA. Per questi campioni, la concentrazione ottenuta dalla curva standard durante l’analisi dei risultati deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione.

Calcolo del coefficiente di variazione

La variazione del coefficiente (CV) è il rapporto tra la deviazione standard σ e la media µ:

Cv = σ
µ

Questo è espresso come percentuale di varianza rispetto alla media e indica eventuali incongruenze e imprecisioni nei risultati. La varianza maggiore indica una maggiore incoerenza ed errore. Alcuni programmi per computer possono calcolare i valori CV dai risultati ELISA.

Alto CV può essere causato da:

  • Pipettaggio impreciso; garantire puntali sono sigillati per la pipetta prima dell’uso in modo che redige per il corretto volume di liquido
  • Spruzzi di reagenti tra i pozzi.
  • Batteriche, fungine e di contaminazione di uno schermo di controllo o campioni
  • contaminazione incrociata tra i reagenti
  • le variazioni di Temperatura attraverso la piastra; garantire le piastre sono state incubate in un stabile a temperatura ambiente lontano da correnti d’aria
  • Alcuni dei pozzi di essiccazione; assicurarsi che le piastre siano sempre coperte durante le fasi di incubazione

Recupero del picco

Il recupero del picco determina l’effetto che i costituenti del campione hanno sulla rilevazione dell’antigene da parte dell’anticorpo. Ad esempio, le molte proteine contenute nel surnatante di coltura tissutale possono ostacolare il legame anticorpale e aumentare il rapporto segnale-rumore, con conseguente sottostima della concentrazione target.

Le concentrazioni note di proteina sono appuntite sia nella matrice del campione che in un diluente standard. La proteina a spillo viene quantificata utilizzando il test e vengono confrontati i risultati della matrice campione e del diluente standard.

Se i risultati sono identici, la matrice campione è considerata valida per la procedura di analisi. Se il recupero è diverso, i componenti nella matrice del campione interferiscono con il rilevamento dell’analita.

Cosa succede se un esperimento di recupero spike indica che la matrice campione sta influenzando i risultati?

Si consiglia di produrre la curva standard utilizzando lo standard diluito nella matrice del campione. Eventuali effetti sui risultati della matrice campione saranno presenti anche nello standard, e quindi il confronto tra la curva standard e i campioni è più accurato. Molti dei nostri kit ELISA contengono un diluente siero standard per questo scopo.

Un’altra soluzione consiste nell’alterare la matrice campione. Ad esempio, se si utilizza un campione biologico pulito, provare a diluirlo nel diluente standard. Tuttavia, con questa opzione, è necessario assicurarsi che il fattore di diluizione sia preso in considerazione durante l’analisi dei risultati e che la concentrazione rimanga all’interno della sezione lineare della curva standard.

Vedere di più dei nostri kit ELISA, reagenti e protocolli o rivedere i nostri array di anticorpi a membrana, come cytokine array ab133997, che può essere utilizzato per misurare molte proteine contemporaneamente.

ELISA guida

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