RISC: hen liittyvien AGO-jäsenten evoluutio

AGO-proteiiniperheellä on keskeinen rooli RISC-välitteisten geenien säätelyssä. AGOs sisältää pääasiassa neljä tyypillistä domeenia: N-terminaalinen, PAZ (joka vastaa pienestä RNA: sta), Mid-ja C-terminaalinen PIWI (joka antaa katalyyttistä toimintaa) domeeni (täydentävä Figs S1 ja S2)18,19. Useat koodaamattomat Rnat ovat niiden substraatteja, mukaan lukien mirnat, sirnat ja Piwi-vuorovaikutuksessa olevat rnat (pirnat)20. Pienet RNA: t ohjaavat Agoja tiettyihin kohteisiinsa sekvenssien komplementaarisuuden kautta, mikä tyypillisesti johtaa kohteen hiljentymiseen lähinnä transkription jälkeisellä inhibitiolla tai mRNA: n hajoamisella.

AGO2 ja sen homologiat on tunnistettu Chordatasta, Arthropodasta, Nematodasta ja Platyhelminthesistä, ja agoksen fylogeneettinen puu rakennettiin (viikuna. 1A ja täydentävä Kuva. S3). Nämä Agot jaettiin RNA: ta sitovien ominaisuuksiensa tai toimintojensa mukaan kolmeen luokkaan: I) monitoimiagot; II) siRNA-Agot; ja III) piRNA-Agot. Luokan I Agot sisältävät soinnillisen AGO1–4: n, jossa kaikki ihmisen Agot yhtyvät sekä sirnoihin että mirnoihin. Kuten kuvassa. 1A, soinnillinen AGO1-4 sisältää kaksi alaluokkaa: AGO2 ja AGO1/3 / 4. Vain AGO2-proteiini toimii endonukleaasina ja pilkkoo mRNA: ta alueilla, jotka emäspari täysin toisiaan täydentävien sirnojen tai mirnojen kanssa. AGO1 / 3 / 4 ovat viipaloimattomia AGOs21,22 ja poistavat matkustajien säikeitä ohitusmekanismin kautta. Luokan II Agot sitoutuvat erityisesti Sirnoihin, jotka sisältävät Artropodaa (Drosophila AGO2) ja Nematoda Agosia (TAG-76/ERGO1/WAGO1/YQ53/NRDE3). Artropodan ja Nematodan agoilla on evolutiivisia komplekseja verrattuna nisäkäsagojen monofyleettiseen ryhmään (viikuna. 1A ja täydentävä Kuva. S3). Drosophila AGO2, osana RISC-kompleksia, tarvitaan sirnan dupleksin purkamiseen ja sirnan yhdistämiseen RISC: ksi Drosophilan alkioissa. Drosophila AGO2: lla oli läheinen evolutiivinen suhde kasvi/Chordata Agosin (täydentävä viikuna. S3). AGO1 on tarpeeton tehokkaalle RNAi: lle Drosophila embryos23: ssa, mutta sitä ei katsota Uniprotissa ja ei annotoitu Kuvassa. 1A. fylogeneettinen puu ja PFAM / SMART-pohjainen verkkotunnuksen rakenteet osoittavat, että TAG-76 (Caenorhabditis elegans, C. elegans) on vaatimaton yhtäläisyyksiä nisäkäs AGOs (täydentävä viikuna. S2). Valitettavasti sen biologinen tehtävä on vielä epäselvä, mutta muut Nematoda-proteiinit osallistuvat RNAi-reitille. ERGO-1 toimii an: nä ja toimii endogeenisellä RNAi pathway24: llä. WAGO1 on mato-spesifinen AGO ja hiljentää tietyt geenit, transposonit, pseudogeneetit ja kryptisen loki25: n. Uncharacteristed YQ53 kanssa PAZ ja PIWI verkkotunnuksia esitetty täydentävä Kuva. S2: lla on mahdollinen endogeenisen ja eksogeenisen RNAi18: n funktio. Toinen ydinvoima sitten proteiini, NRDE3, sitoutuu siRNAs ja tarvitaan ydinvoima RNAi, ja näin kuljettaa tiettyjä luokkia pienten säätelevien RNAS erillisiin solulokeroihin säätelemään geenin ekspression26. Luokan III Agot koostuvat soinnillisesta PIWIL1-4: stä, Arthropoda AGO3/AUB/ PIWI/SIWISTÄ ja Platyhelminthes PIWIL/PIWI1/PIWI2: sta. PIWI-suvun jäsenet PIWIL1-4 sitoutuvat pirnoihin ja ilmenevät yksinomaan ituradan soluissa, mutta muut Agot ilmenevät kaikkialla useimmissa kudoksissa27. Lisäksi täydentävä Kuva. S3 osoittaa, että muut Artropoda AGO2-sukuiset proteiinit ovat lähellä soinnillisen PIWIL1-4: n alaluokkaa, ja piRNAs ohjaa niitä irrottamaan transposonitranskriptit ja ohjeistaa Piwiä tukahduttamaan transposonitranskription suojaamaan Sukusolujen perimää Drosophila munasarjojen sukusoluissa. Piwi-proteiiniperheen jäseniä (PIWIL, PIWI1 ja PIWI2) on tunnistettu myös Platyhelminteistä (Dugesia japonica ja Schmidtea mediterranea). Niillä on samankaltaisia domeeneja kuin eläinagoilla, ja niitä voidaan tarvita kantasolujen toimintaan ja pirnan biogeneesiin (täydentäviä viikunoita S2 ja S3)28,29.

aiemmissa tutkimuksissa on määritetty kolme Agos-kladia kasveissa30. Esimerkiksi Arabidopsis thaliana (A. thaliana) on jakautunut kymmenen jäsentensä kanssa tasaisesti kolmeen kladiin: I) AGO1, AGO5, AGO10; II) AGO2, AGO3, AGO7; ja III) AGO4, AGO6, AGO8, AGO9. Näiden tulosten mukaisesti analyysimme osoittivat kolme suurta kladia, ja nämä kasviagot ryhmiteltiin keinotekoisesti kolmeen luokkaan niiden toimintojen perusteella: I) monitoimiagot, II) siRNA-Agot ja III) toisiaan täydentävät toimivat Agot. Proteiinisekvenssin identiteettiin perustuvat BLASTIPISTEET eivät kuitenkaan anna tarkempia luokituksia (Fig. 1A ja täydentävä Kuva. S3). Luokan I Agot ovat AGO1/AGO5/AGO10 (A. thaliana) ja AGO1A/AGO1B/AGO1C/AGO1D/AGO11/AGO12/AGO13/AGO14/AGO17/AGO18/PNH1 / MEL1 (Oryza sativa, O. sativa). AGO1 vaikuttaa miRNA-ja siRNA-reitteihin, ja AGO10 mahdollisesti osallistuu näihin reitteihin ainakin joissakin kudoksissa; sekä tumassa että sytoplasmassa lokalisoitunut AGO5 sitoutuu pieniin RNA: iin ja säätelee RNA-välitteistä post-transkriptiogeenin vaientamista31. PNH1 (O. S. sativa) vaikuttanee versoapikaalisen meristeemin ja lehtien adaksiaalisen solun spesifikaation muodostumiseen ja RNA: n vaimentavaan polku32,33. MEL1 todennäköisesti välittää pieniä RNA-sukuisia geenejä hiljentäen ja sen toiminnan voi suorittaa toinen sitten Arabidopsis33: ssa. Luokan II Agot sisältävät AGO2/AGO3/AGO7 (A. thaliana) ja AGO2/AGO3 / AGO7(O. sativa). AGO7 toimii rdr6/SGS3 / DCL4 / AGO7-transvaikutteisella siRNA-reitillä, joka osallistuu lehtien kehitysaikatauluun. AGO2 / 3: lla ei ole DDH-motiivia PIWI: n alueella, ja niillä on mahdollisesti samankaltaista toimintaa; AGO2/AGO3-mutanteilla ei ole kehityshäiriöitä. Luokan III Agot sisältävät AGO4/AGO6/AGO8/AGO9 (A. thaliana) ja AGO4A/AGO4B/AGO15 / AGO16 (O. sativa). Näillä Agoilla on toisiaan täydentäviä biologisia tehtäviä. AGO4 on mahdollisesti jakautunut eri ydinkomplekseihin ja erilliseen polku34. Ago6: ta tarvitaan heterokromatiini siRNA: n ja transkriptiogeenin hiljentämisreitteihin, ja AGO6: n aktiivisuus on osittain redundanttia AGO4: n aktiivisuuden kanssa. AGO8 / 9 (A. thaliana) mrnoilla on erilainen kudosjakauma, eikä niiden mutanteilla ole vaikutusta kasvien fenotyyppeihin. Sekvenssidentiteettien perusteella on olemassa selkeä ryhmä I-luokan jäseniä (oranssit), mutta II-luokan (vihreät) ja III-luokan jäsenten (tummanvihreät) välillä on päällekkäinen alue (viikuna. 1 A). Atagosta on tutkittu vuosikymmeniä, mutta monia kysymyksiä on yhä jäljellä. Osagoilla näyttää olevan suurempi diversiteetti ja geenien kahdentuminen, koska monet isoformit tunnistettiin Fig: ssä esitetyllä tavalla. 1A ja täydentävä Kuva. S3.

yksittäinen PIWI-verkkotunnuksia sisältävä aine on tunnistettu Protista Giardia intestinalis (Giardia lamblia) – genomissa ja säätelee variantispesifisen pintaproteiinin (VSP) ilmentymistä kunkin loisen pinnalla RNAi-reitin (Supplementary Figs S2 and S3)35 kautta. Yllättäen sienistä löytyi yksi ago1, jossa on hiivasta peräisin olevia PAZ-ja Piwi-domeeneja ja joka sijaitsee tiiviisti kasvien kolmannessa kladissa (täydentävät viikunat S2 ja S3). Sillä voi olla sekvenssispesifistä DNA: n sitoutumisaktiivisuutta, ja sen yksityiskohtaista roolia RISC: ssä voitaisiin tutkia perusteellisesti.

RISC: hen liittyvien Dicer-jäsenten evoluutio

RNAi-prosessi syntyy RNA-molekyylien ja RISC: n välisestä vuorovaikutuksesta. Dicer ankkuroi dsRNA-molekyylin ja leikkaa sen tuottaakseen lyhyitä dsrnoja ensisijaisena RNA: n tunnistus-ja prosessointientsyyminä RNAi-prosessissa. Dicer kuuluu RNaasi III-sukuun ja on evoluutiossa hyvin säilynyt. Sekvenssianalyysit osoittavat, että kunkin lajin Dicerillä on samanlaiset verkkotunnukset. Useimmilla lajeilla Dicerin n-pääte on RNA-helikaasi-domeeni, jota seuraa PAZ-domeeni (Supplementary Fig. S1). Dicerin C-terminaalissa on kaksi RNase III-domeenia ja dsRNA-sitova domain36.

kuutioita esiintyy eukaryooteissa laajalti. Nykyinen DICER-sukuun kuuluva fylogeneettinen puu osoittaa itsenäistä monipuolistumistaan eläimissä, kasveissa ja sienissä (viikuna. 1B ja täydentävä Kuva. S4). Erotuksena fylogeneettisestä eläinagoksen puusta, monofyleettiseen ELÄINDIKERIN ryhmään todettiin kuuluvan Chordata, Arthropoda ja Nematoda, ja yksi luokka syntyi toiminnallisesti: monitoimidikerit. Nämä DICERs hallussaan kaksitoiminen tunnistaa hiusneula tai dsRNA ja jalostamalla ne kypsä miRNA-miRNA* / siRNA duplexes. On huomionarvoista, että Arthropoda DICER (Drosophila DCR1) tarvitaan mirnan biogeneesiin, ja uniprotissa oleva Drosophila DICER paralogue DCR2 voi olla sirnasin tuottamiseen. Nematoda DICERIN (C. elegans DCR1) helikaasumotiiveja tarvitaan sirnalle, mutta ei mirnalle, prosessille 37,38,39,40. Pirnan käsittelyyn tarvittava Dicer on edelleen tunnistamaton. Lisäksi rakennettu soinnillinen alaluokka sisältää DDX58, DHX58, IFIH1, FANCM ja RNC (Kuva. 1B ja täydentävä Kuva. S4). Niillä kaikilla on helikaasiaktiivisuus, mutta DDX58 ja DHX58 sitoutuvat DNA: han, ja IFIH1: llä ja FANCM: llä on RNA: ta sitovia affiniteetteja. Toiminnallisesti ne voisivat osallistua RISC – tyyppisiin komplekseihin ja reagoida eksogeeniseen stressiin. RNC koodaa dsRNA-spesifistä Rnaasia III.

laitoksissa on neljä kuutiota (DCL1-4) 38. Täydentävä Kuva. S4: ssä on monofyleettinen kasvidikereiden ryhmä, jossa on neljä alaluokkaa: DCL1, DCL2, DCL3 ja dcl4. Kasvien pienten RNA: iden kypsytystyyppien perusteella nämä kuutiot ryhmiteltiin kahteen luokkaan: I) monitoimiset kuutiot (DCL1); ja II) siRNA-liitännäiset kuutiot (DCL2-4). DCL1 osallistuu RISC: n muodostumiseen prosessoidakseen miRNA/siRNA-esiasteita. AtDCL2 – 4 tuottaa sirnoja ja ne osallistuvat viruksen puolustukseen ja sirnojen tuotantoon luonnollisista cis-vaikutteisista antisense-transkripteistä, kromatiinin modifiointiohjauksesta tai vegetatiivisesta faasimuutosasetuksesta39,40,41. RTL3 (O. sativa) kuuluu dcl1-alalahkoon ja RNaasi III-sukuun, mikä viittaa siihen, että siihen liittyy mahdollisesti miRNA/siRNA-reitti. Lisäksi O. sativa, mikä viittaa siihen, että riisin DICER-evoluution aikana on saattanut tapahtua geenien kahdentumistapahtuma. Kasvikladi etsii outgroupia, mukaan lukien RTL3 (A. thaliana) ja RTL2 (A. thaliana ja O. sativa), jotka ovat ribonukleaaseja, jotka pilkkovat dsRNA: ta ja tuottavat pieniä RNA: ita.

sienten (Ascomycota) kuutioissa on kaksi alaluokkaa, joita tukee bootstrap-arvo 64: (I) DCL1, DCR1(Schizosaccharomyces pombe, S. pombe); ja (II) DCL2 (Kuva. 1B ja täydentävä Kuva. S4). Vegetatiivisissa soluissa dcl2 on sirnan biogeneesissä merkittävä Dicer-entsyymi, mutta dcl1: llä on redundantti role42. Kuitenkin vain DCL1 on nimenomaisesti ilmaistu ja vaaditaan meioottisen hiljentämisen aikana meiosis43. SiRNA-kypsytysprosessissa dsRNA: n esiasteita käsitellään dcr1: llä, jossa on samanlaisia kanonisen DICERIN domeeneja eläimillä. DCR1 (S. pombe) on Fissiohiivassa esiintyvä Dicer-homologue. MPH1 on ATP-riippuvainen DNA-helikaasi, joka liittyy DNA-vauriovasteeseen ylläpitämään genomin integrity44. Hiivamfh2: lla on DNA: ta sitova ja DNA: n helikaasiaktiivisuus. Muut kladit ovat pääasiassa bakteereista RNC (Actinobacteria, Aquificae, Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes ja Thermotogae), jotka koodaavat RNaasi ja cleave RNAs (Kuva. 1B ja täydentävä Kuva. S4).

RISC: hen liittyvien TRBP: n ja PACT: n jäsenten kehitys

TRBP liittyy HIV-1-geenin ekspressioon45, mikä mahdollisesti yhdistää miRNAs: n ja IFN-PKR: n vasteen HIV-1-infektioon46. Selkärankaisilla TRBP on paralogi proteiinikinaasi R: ää (PKR) aktivoivalle proteiinille eli PACT46,47: lle. Ne säätelevät PKR: ää inhibiittorina (TRBP) tai aktivaattorina (PACT). RISC: hen liittyvät trbp: n biologiset toiminnot ja/tai sopimus kolmen DRSM-domeenin kanssa (jotka sitoutuvat dsRNAs: ään ja välittävät proteiini-proteiini-vuorovaikutusta), esitetty täydentävässä Kuvassa. S2, ovat seuraavat: substraattien värvääminen kuutioon, epäkypsien mirnojen Dicer-välitteisen käsittelyn helpottaminen, Dicer-tuotteen poistaminen ja sen valvonta, minkä tyyppinen dsRNA Ladataan AGOs12,13: een.

fylogeneettisissä puissamme TRBPs / sopimukset näkyvät vain Kordatassa (Kuva. 1C, D ja täydentävät viikunat S5 ja S6). Muuten Drosophila R2D2 ja C. elegans RDE-4, molemmat tunnettuja RNAi-prosessointiin osallistuneita, ovat kaukaista sukua TRBP/PACT: lle eivätkä esiinny TRBP / PACT: n soinnillisissa kladeissa. Loquacious on tunnistettu hyönteisissä, mutta niitä ei pidetä alhaisen sekvenssin identiteetin ja uniprotissa esiintymättömän merkinnän vuoksi (kuva. 1C, D). Muita evolutionaarisesti RNA: ta/DNA: ta sitovia geenejä ovat DSRAD (Chordata), STAU1/2/STAUH (Chordata, Mollusca ja Arthropoda), ILF3 (Chordata), STRBP (Chordata), RED1/2 (Chordata) ja RNC (Chloroflexi ja Proteobakteerit). Dsradit osallistuvat RNA-muokkaukseen ja helpottavat mirnan lataamista RISC48: aan. Chordate STAU1 / 2 / STAUH näyttää toimivan mRNA-kuljetuksessa tai jakautumisessa49,50, ja Mirna-esiasteiden tapaan vienti-5 kuljettaa Staufen-dsRNA-komplekseja ulos nukleus51: stä. Kordaatti ILF3 sitoutuu RNA: han ja toimii kehän RNAS: n (circRNAs) biogeneesissä. Soordaatti STRBP säätelee spermatogeneesiä ja siittiöiden toimintaa sitomalla dsDNA/RNA: ta. Soordaattipuna1 katalysoi A-to-I RNA-muokkausta vaikuttaakseen geenien ilmentymiseen ja toimintaan. Adenosiinideaminaasiaktiivisuus ja dsRNA / ssRNA-sitoutumisaffiniteetti estävät muiden ADAR-entsyymien sitoutumisen kohteisiin ja heikentävät näiden entsyymien tehokkuutta. Kloroflexi-ja Proteobakteerien RNC-yhdisteet kuuluvat RNaasi III-sukuun. Yllättäen DRB2 (O. sativa) ja IIV6-340r (selkärangattomat iridescent virus 6) sijaitsivat soinnillisen DSRAD: n kladeissa ja bakteeriperäisen RNCs: n kladeissa FYLOGENEETTISESSÄ PACT-puussamme (Kuva. 1D ja täydentävä Kuva. S6). Ne mahdollisesti sitoutuvat ja pilkkovat RNA: ita kasveissa tai niiden isännässä, mutta niiden RISC: hen liittyviä tehtäviä ei vielä tunneta.

RISC: hen liittyvien gw182: n jäsenten

gw182, jotka on tunnistettu eläimillä, evoluutio on keskeinen osa RISC: tä, vaikuttaa PIWI: n ago1: n domeeniin sen n-terminaalialueen kautta miRNA-välitteisen geenin säätelyyn (täydentävä Kuva. S1) ja esiintyy suuria eroja järjestyksessä pituus, konservointi ja koostumus. Tässä tutkimuksessa käytettiin luotettavaan fylogeneettiseen rekonstruktioon gw182: n ja sen ortologioiden kokopitkiä sekvenssejä, jotka olivat yhtäpitäviä aiempien tulosten kanssa (Supplementary Fig. S7) 17. Tulokset osoittavat, että nisäkäs TNRC6C on perustajajäsen soinnittomien GW182-geenien ortologiasta ja siitä poikkeavassa soinnillisessa geeniperimässä.

tutkimuksessamme tunnistettiin ja luonnehdittiin rajallinen määrä GW182: ta, muun muassa ihminen, hiiri ja Kärpänen (Kuva. 1E ja täydentävä Kuva. S7). Gw182 mRNA/protein-bakteeria koskevassa TIETOKANTAHAKUANALYYSISSÄ ei havaittu muita homologeja, joilla olisi erittäin vakuuttavia sekvenssien yhtäläisyyksiä ja biologisia toimintoja edes Nematodassa. Sen sijaan C. elegansin genomiin on koodattu kaksi toiminnallista analogia, AIN-1 ja AIN-2. Havainto ei ole yllättävä, sillä yli puolet Nematodaan koodatuista geeneistä52.

RISC: n tärkeimpien jäsenten geenien monistumisanalyysi

geenien kahdentuminen on fenotyypin moninaisuuden ratkaiseva liikkeellepaneva voima, ihmisten sairauksien aiheuttaja ja evoluutio. Tutkimuksessamme kvantifioimme RISC: n jäsenten geenien kahdentumistapahtumat. Agosin puussa tunnistettiin 51 geenikopiota(Supplementary Fig. S8). Eläinagosin I, II ja III Luokka sisälsivät 6, 4 ja 14 geenin kaksoiskappaleita. Plant Agosin luokka I, II ja III sisälsivät vastaavasti 13, 3 ja 5 geenikopiota. Kuutioiden puusta määritettiin 61 geenikopiota (Supplementary Fig. S9). Tästä eläinkokeiden luokasta 4 geenin kahdentumista syntyi Kordatasta. Kahdessa kasvimittariluokassa vain II luokassa oli 6 geenikopiota. Trbp/PACT/GW182-geenien kaksoiskappaleita oli 68/27/10, joissa niiden läheisten geenikaksosten numerot olivat 1, 3 ja 2 (täydentäviä viikunoita 10-12). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Agos-ja Dicer-geenien runsas kahdentuminen saattaa olla tärkein tekijä evolutiivisessa monimuotoisuudessa.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.