Muestras que tienen un valor de absorbancia que se sale del rango de la curva estándar

Para obtener un resultado preciso, estas muestras deben diluirse o concentrarse antes de proceder con la tinción ELISA. Para estas muestras, la concentración obtenida de la curva estándar al analizar los resultados se multiplicará por el factor de dilución.

Cálculo del coeficiente de variación

La variación del coeficiente (CV) es la relación entre la desviación estándar σ y la media µ:

Cv = σ
µ

Esto se expresa como un porcentaje de varianza a la media e indica cualquier inconsistencia e inexactitud en los resultados. Varianza mayor indica mayor inconsistencia y error. Algunos programas informáticos pueden calcular los valores CV a partir de los resultados de ELISA.

Un CV alto puede ser causado por:

  • Pipeteo inexacto; asegúrese de que las puntas de la pipeta estén selladas a la pipeta antes de su uso para que se preparen para corregir el volumen de líquido
  • Salpicaduras de reactivos entre pocillos
  • Contaminación bacteriana o fúngica de muestras de cribado o reactivos
  • Contaminación cruzada entre reactivos
  • Variaciones de temperatura en la placa; asegúrese de que las placas se incuban en un entorno de temperatura estable, lejos de corrientes de aire
  • Algunos de los pocillos se secan; asegúrese de que las placas estén siempre cubiertas en los pasos de incubación

Recuperación de picos

La recuperación de picos determina el efecto que los constituyentes de la muestra tienen en la detección del antígeno por el anticuerpo. Por ejemplo, las muchas proteínas contenidas en el sobrenadante de cultivo de tejidos pueden dificultar la unión de anticuerpos y aumentar la relación señal / ruido, lo que resulta en una subestimación de la concentración objetivo.

Las concentraciones conocidas de proteínas se añaden a la matriz de la muestra y a un diluyente estándar. La proteína enriquecida se cuantifica utilizando el ensayo y se comparan los resultados de la matriz de muestra y el diluyente estándar.

Si los resultados son idénticos, la matriz de muestra se considera válida para el procedimiento de ensayo. Si la recuperación es diferente, los componentes de la matriz de muestra están interfiriendo con la detección de analitos.

¿Qué pasaría si un experimento de recuperación de picos indicara que la matriz de muestra está afectando los resultados?

Recomendamos producir la curva estándar utilizando diluido estándar en la matriz de muestra. Cualquier efecto sobre los resultados de la matriz de la muestra también estará presente en el estándar, y por lo tanto la comparación entre la curva estándar y las muestras es más precisa. Muchos de nuestros kits ELISA contienen un diluyente de suero estándar para este propósito.

Otra solución es alterar la matriz de muestra. Por ejemplo, si se utiliza una muestra biológica limpia, intente diluirla en diluyente estándar. Sin embargo, con esta opción, deberá asegurarse de que se tenga en cuenta el factor de dilución al analizar los resultados y de que la concentración se mantenga dentro de la sección lineal de la curva estándar.

Vea más de nuestros kits, reactivos y protocolos ELISA o revise nuestras matrices de anticuerpos de membrana, como la matriz de citoquinas ab133997, que se puede usar para medir muchas proteínas simultáneamente.

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