Die EGFR-TKIs weisen im Vergleich zur Standardchemotherapie19 eine spezifischere klinische Wirksamkeit auf, wenn sie als Zweitlinien- oder Drittlinientherapie bei fortgeschrittenem NSCLC verabreicht werden. Es wurde jedoch gezeigt, dass 60% der Patienten, die 6 bis 10 Monate lang mit TKI behandelt wurden, schließlich eine Resistenz gegen TKIs entwickeln würden. Die Arzneimittelresistenz wurde in primäre und sekundäre Resistenz (erworbene Resistenz) eingeteilt. Normalerweise Patienten, die TKIs für ungefähr 2 Wochen erhielten, zeigten eine Verbesserung der klinischen Symptome, wie Tumormasse in der Radiographie reduziert und Wirkungsbewertung, einschließlich vollständiger Remission (CR), partieller Remission (PR) oder stabiler Krankheit (SD) zu einem bestimmten Zeitpunkt. Wenn Tumore während der Erstbehandlung keine offensichtliche Reaktion auf TKIs zeigen, spricht man von Primärresistenz. Sekundärwiderstand (erworbener Widerstand) ist in der Definition ziemlich unterschiedlich; ein scheinbar vorteilhafter Behandlungseffekt kann nach Beginn der Einnahme von TKIs beobachtet werden, aber nach 6 bis 10 Monaten Behandlung kann der Tumor nicht mehr unterdrückt werden und kann sogar an Größe zunehmen, was zu keiner Verbesserung der Behandlung führt. Gegenwärtig wurden viele Mechanismen der Resistenz gegen TKIs identifiziert, aber Mechanismen der Primärresistenz sind nicht klar. Der am besten beschriebene Mechanismus der Primärresistenz ist eine Mutation im KRAS-Onkogen, die bei 20 bis 30% der Lungenkrebspatienten vorliegt. Es wurde berichtet, dass der Hauptmechanismus der erworbenen Resistenz die T790M-Mutation im Exon 20 des EGFR-Gens ist20,21. Andere Mechanismen umfassen die Amplifikation des MET-Gens20,21, PIK3CA-Mutation21,22, BRAF-Mutation23, epithelial-mesenchymaler Übergang (EMT)21 und kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC) Transformation20,21.

Es wurde von zwei Gruppen berichtet, dass eine sekundäre Threonin-zu-Methionin-Mutation am Codon 790 (T790M) des EGFR-Gens mit einer erworbenen Resistenz gegen Gefitinib und Erlotinib (TKIs der ersten Generation) 24,25 zusammenhängt. Die Kristallstrukturmodellierung hat gezeigt, dass sich der Rückstand T790 in der ATP-Bindungstasche der katalytischen Region von EGFR befindet und für die Bindung von Erlotinib und Gefitinib24 kritisch zu sein scheint. Die Substitution des Threonins am Codon 790 mit einem sperrigeren Rest, wie Methionin, würde zu einer sterischen Behinderung der Bindung dieser beiden Arzneimittel führen. Eine sekundäre T790M-Mutation wurde in einem Tumor identifiziert24 und in drei von sechs Tumoren25 mit erworbener Resistenz gegen Gefitinib. In unserer Studie fanden wir heraus, dass die primäre Mutationsrate von T790M 1,6% (3/177) und die sekundäre Mutationsrate 42 betrug.8% (15/35). Diese Änderung unterstützt weiter, dass die T790M-Mutation eine wichtige Rolle bei der Entwicklung erworbener Resistenzen spielen kann.

Zu den Nachweismethoden für T790M-Mutationen gehörten die direkte Sequenzierung (DS), das Amplification Refractory Mutation System (ARMS), die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR), die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) und die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS). Für die erkennung von T790M, diese erkennung methoden haben ihre eigenen vorteile und nachteile: 1. Im Vergleich zu ddPCR und NGS ist der Erkennungsprozess von ARMS und Super-ARMS relativ einfach und schnell, und die Kosten sind niedriger, aber die Empfindlichkeit ist etwas niedriger. 2. Verglichen mit ARMEN und Superarmen ist die Empfindlichkeit von ddPCR und NGS etwas höher, aber der Erkennungsprozess ist komplex und die Kosten sind höher. Die direkte Sequenzierung ist eine Standardmethode zum Nachweis von T790M-Mutationen in China, aber der Prozess ist langwierig, zeitaufwändig und die Empfindlichkeit ist geringer26. Die meisten Mutationen sind somatische Mutationen, mutierte Zellen, die normalerweise mit Wildtypzellen gemischt werden; daher weist die extrahierte DNA häufig eine große Menge an Wildtyp-DNA auf, so dass der Nachweis von Mutationen an somatischen Zellen eine höhere Spezifität erfordert. Gegenwärtig ist die direkte Sequenzierung begrenzt und kann die klinischen Anforderungen nicht erfüllen. Die Superarme, die wir in dieser Forschung verwendet haben, ist eine aktualisierte Technologie, die auf traditionellen WAFFEN basiert. Wir fügten dem Super-ARMS-Primer eine selbstringige Struktur hinzu, die während des Glühschritts geöffnet und mit einer Zielsequenz begrenzt werden kann, um den Nachweis einer bestimmten Mutation zu erreichen. Diese Struktur verstärkte die Unterscheidungsfähigkeit des Primers und verbesserte somit die Spezifität und Sensitivität des Assays. In unserer Studie waren die Sensitivität, Spezifität, PPV, NPV und Genauigkeit der Superarme 100.0%, 99.4%, 94.7%, 100.0% und 99.5%, beziehungsweise. Seine Empfindlichkeit war höher als bei herkömmlichen ARMEN (48,2–63,6)26,27, und andere Parameter stimmten im Wesentlichen mit früheren Studien überein26,27. Es gibt zwei Vorteile von Superarmen im Vergleich zu ARMEN. Erstens wurde die Erkennungsempfindlichkeit von Super ARMS stark verbessert (0.2% versus ARMS-Sensitivität von 1%), so dass mehr Patienten mit EGFR-Mutationen nachgewiesen werden können. Zweitens ist Super ARMS im Vergleich zu ARMS aufgrund seiner höheren Empfindlichkeit besonders für Plasmaproben geeignet. Die digitale PCR (dPCR) ist eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von Genmutationen, die auf der Kompartimentierung und Amplifikation einzelner DNA-Moleküle basiert. Die Quantifizierung von Kompartimenten mit Endpunktfluoreszenz nach dem PCR-Prozess zeigt die Anzahl der Kopien der Ziel-DNA. Droplet Digital PCR (ddPCR) ist eine solche dPCR-Technologie, die auf der Kompartimentierung von DNA in Tröpfchen basiert. In der ddPCR werden einzelne DNA-Fragmente in mehr als eine Million Tröpfchen kompartimentiert, die dann parallel amplifiziert werden. ddPCR ist eine vielversprechende Technologie, da Geschwindigkeit, Kosten und Benutzerfreundlichkeit anderen PCR-basierten Assays ähneln, die Empfindlichkeit und quantitative Natur dieses Assays jedoch breitere klinische Anwendungen bietet. Derzeit hat sich ddPCR als effiziente und zuverlässige Methode zum Nachweis der T790M-Mutation28,29. Daher wurden alle Proben von Super ARMS in unserer Studie erneut von ddPCR verifiziert. Insbesondere wurde eine Probe als falsch positiv beurteilt, wenn im Vergleich zu ddPCR Ergebnis. Zwei Gründe können für dieses Problem verantwortlich sein. Zuerst lag die Erkennung des Ergebnisses nahe am kritischen Wert und wurde dann als positiv falsch eingeschätzt. Darüber hinaus kann eine PCR-Kontamination auch zu falsch positiven Ergebnissen führen. Trotz eines falsch positiven Falls kann die Technik weiter verbessert und intensiviert werden.

Die EGFR-Mutationsrate betrug 30.1% (64/212) bei Patienten mit NSCLC, die im Bereich früherer Studien (30-50%)3,30,31,32 lagen. In ähnlicher Weise waren Frauen, Nichtraucher, Hirnmetastasen und Adenokarzinome in dieser Studie mit einer höheren Rate von EGFR-Mutationen assoziiert. Teilweise haben wir gerade die Prävalenz der EGFR-T790M-Mutationen in der Provinz Yunnan im Südwesten Chinas untersucht.

Die T790M-Mutationsrate betrug 8,4% bei Patienten mit NSCLC, was im Bereich früherer Berichte lag33,34. In den Nicht-TKI-Plasmaproben waren Frauen, Nichtraucherinnen und Adenokarzinome in dieser Studie nicht signifikant mit einer höheren T790M-Mutationsrate bei NSCLC-Patienten assoziiert. Dies war ähnlich wie bei anderen früheren Studien34,35. Hirnmetastasen korrelierten mit einer höheren T790M-Mutationsrate bei NSCLC-Patienten. Ähnlich war es auch bei anderen Berichten34,35. Die T790M-Mutationsrate betrug jedoch 0,0% (0/31) im TNM-Stadium (Ia-IIIa). Insbesondere war es niedriger als die T790M-Mutationsrate im TNM-Stadium (IIIb-IV), die 9,9% (18/181) betrug; Im TNM-Stadium wurde kein signifikanter Zusammenhang gefunden. Obwohl dies nicht mit anderen früheren Studien übereinstimmt, wurde seine Tendenz ausgeprägt36. Es gibt drei Erklärungen, die diesen Streit besser erklären können. Zunächst haben wir in dieser Studie nur verfügbare Daten gesammelt, die zu einem Selektionsbias führen können. Zweitens reichte die Anzahl der Proben nicht aus, um die Beziehung zwischen den T790M-Mutationen und dem TNM-Stadium des NSCLC in der Provinz Yunnan widerzuspiegeln. Schließlich ist die Biopsie immer noch der Goldstandard für den Nachweis von T790M-Mutationen. Da jedoch Plasma verwendet wurde, um die Mutation von T790M in dieser Studie nachzuweisen, kann dies auch zu einer Verzerrung führen. In den Post-TKI-Plasmaproben waren Frauen, Nichtraucherinnen und Adenokarzinome in dieser Studie nicht signifikant mit der höheren T790M-Mutationsrate bei NSCLC-Patienten assoziiert. Dies war bei anderen früheren Studien34 ähnlich. Hirnmetastasen korrelierten mit einer höheren Rate von T790M-Mutationen, was in guter Übereinstimmung mit anderen Berichten stand35. Die T790M-Mutationsrate betrug 42,8% (15/35) im TNM-Stadium (IIIb-IV). Daher korrelierte die Hirnmetastasierung unabhängig vom TKI-Behandlungsstatus mit einer höheren Rate von NSCLC-Patienten.

In den Nicht-TKI-Plasmaproben betrug die T790M-Mutationsrate 1.6% (3/177). Dies war niedriger als in anderen früheren Studien, in denen die ARMS Detective Method verwendet wurde35,37. Daher waren sowohl Super-AMRS als auch ARME für den Nachweis der primären T790M-Mutation begrenzt. In den Post-TKI-Plasmaproben betrug die T790M-Mutationsrate 42,8%, was mit anderen früheren Berichten übereinstimmte35,37 und viel höher als bei den Nicht-TKI-Plasmaproben (p < 0,001). Um weiter zu beweisen, dass der Hauptmechanismus der erworbenen Resistenz eine sekundäre T790M-Mutation ist. Wir analysierten auch die Beziehung zwischen der T790M-Mutationsrate und der Dauer von TKI, um den Mechanismus der erworbenen Resistenz zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Dauer von TKI für 6 bis 10 Monate (p < 0,01) und >10 Monate (p = 0,01) mit einer höheren T790M-Mutationsrate assoziiert waren. Es wurde auch bestätigt, dass viele Patienten, die TKI für mindestens 6 Monate verwendeten, Resistenzen entwickelten und 60-70% der TKI-Resistenz mit der T790M-Mutation38 zusammenhingen. In ähnlicher Weise betrug die T790M-Mutationsrate 66,6% (8/12) in der Dauer der TKI (6-10 Monate). Dies war niedriger als die Dauer der TKI (>10 Monate), 75% (9/12), was mit anderen Berichten übereinstimmte37,38.

Unsere früheren Studien fanden heraus, dass die Rate der EGFR-Mutationen in der Stadt Xuanwei anders war als in der allgemeinen Bevölkerung3, was unsere Untersuchung darüber motivierte, ob die T790M-Mutation in der Stadt Xuanwu regional spezifisch ist. Wir fanden jedoch heraus, dass NSCLC-Patienten in Xuanwei City eine niedrigere T790M-Mutationsrate hatten als Nicht-Xuanwei City in unserer Studie. Darüber hinaus wurde keine signifikante Assoziation im Xuanwei-Ursprung gefunden. Daher können andere Faktoren eine wichtige Rolle für das Fortschreiten und die Entwicklung von Lungenkrebs spielen, mit Ausnahme genetischer Faktoren in der Stadt Xuanwu. Da in unserer Studie Patienten in einem einzigen Zentrum rekrutiert wurden und die Anzahl der Proben von Xuanwei-NSCLC-Patienten nicht groß genug war, konnte unsere Stichprobe die Rate nicht besser widerspiegeln EGFR-T790M Mutationen in Xuanwei City. Weitere Studien werden jedoch erwartet.

Patienten mit EGFR-mutiertem NSCLC erhalten einen signifikanten therapeutischen Nutzen von TKIs. Leider ist erworbene Resistenz eine unvermeidliche Folge dieser Behandlungsstrategie. Daher ist es besonders wichtig, eine Behandlungsstrategie zu finden, die die Resistenz von TKIs aufgrund der T790M-Mutation überwindet. Die Behandlungsstrategie für Arzneimittelresistenz in der gegenwärtigen Phase sind wie folgt: 1. Verzögerung der erworbenen Resistenz gegen TKIs: Die Bewertung von Patienten mit Progression bei der Erstlinientherapie mit TKIs hängt hauptsächlich von ab RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors), dies liefert jedoch keine Richtlinien für den Drogenentzug. Einige Patienten haben möglicherweise eine RECIST-Progression basierend auf Tumormessungen, zeigen jedoch einen anhaltenden klinischen Nutzen aus der Therapie. Viele asymptomatische Patienten können einen Therapiewechsel um 2-3 Monate verzögern39. Zwei Studien berichteten, dass einige NSCLC-Patienten empfindlich auf EGFR-Inhibitoren reagierten, und wenn die TKIs unterbrochen wurden, würde dies zu einem beschleunigten Fortschreiten des Krebses führen40,41. Infolgedessen ist es für viele Patienten weiterhin vorteilhaft, TKIs einzunehmen, auch wenn sich eine TKI-Resistenz entwickelt. Es muss jedoch klar sein, wann die TKIs gestoppt werden sollten: (1) Neue metastasierende Läsionen (Hirnmetastasen aufgrund der Blut-Hirn-Schranke nicht eingeschlossen), insbesondere das Auftreten einer Vielzahl von Metastasen. (2) Krankheitsbedingte Symptome nahmen signifikant zu. (3) Der Tumor wächst schnell. 2. TKIs der zweiten Generation: Afatinib ist ein dualer EGFR / HER2-Inhibitor, der jetzt von der FDA für die Erstlinientherapie von Lungenkrebs mit EGFR-L858R-Mutationen oder Exon-19-Deletionen zugelassen ist. NCCN schlug auch vor, Afatinib zu verwenden, um TKIs der ersten Generation zu ersetzen, nachdem sie Arzneimittelresistenz induzieren42. 3. TKIs der dritten Generation: In der Ausgabe 2016 der NCCN, NSCLC Clinical Practice Guidelines, wurde Tagrisso (AZD9291) als Zweitlinienbehandlung für Patienten empfohlen, die die T790M-Mutation aufweisen oder TKI der ersten Generation erhalten haben, die zu einer Arzneimittelresistenz geführt hat15. 4. MET-Hemmung: MET-Amplifikation wird in etwa 5% der Tumoren mit erworbener Resistenz gegen TKIs21 nachgewiesen. Daher können Therapien, die auf MET abzielen, eine wirksame Strategie bei MET-amplifizierten Tumoren sein43. 5. Immuntherapie: Laut einer multizentrischen klinischen Studie kann die erste Generation von monoklonalen TKI + PD-1-Antikörpern in 24 Wochen 19% RR und PFS erreichen44.Insgesamt ist es möglich, Tumor-abgeleitete T790M-Mutationen im EGFR-Gen unter Verwendung von cfDNA von Patienten mit NSCLC unter Verwendung von Superarmen nachzuweisen. Die Rate der T790M-Mutationen bei NSCLC-Patienten der Stadt Xuanwei zeigte keinen signifikanten Unterschied zu den anderen asiatischen Populationen. Unsere Studien zeigten, dass NSCLC-Patienten mit Hirnmetastasen, der Vorgeschichte von TKIs der ersten Generation und der Dauer von TKIs > 6 Monate mit einer höheren T790M-Mutationsrate assoziiert waren. Darüber hinaus wurde Super ARMS verwendet, um die T790M-Mutationsrate nachzuweisen, die einer der wichtigsten jüngsten Durchbrüche in der NSCLC-Onkologie ist. In Anbetracht der Einschränkung unserer Studie sollten weitere Untersuchungen eine große Stichprobengröße aus mehreren Zentren in der Provinz Yunnan untersuchen, um sie repräsentativer für die Gesamtbevölkerung zu machen. Durch die Analyse der Signifikanz und der klinischen Produktivität der Nachweistechnologie für die T790M-Mutation fanden wir heraus, dass die Nachweistechnologie für die T790M-Mutation den Patienten helfen könnte, sich für eine Behandlungsstrategie zu entscheiden, Behandlungskosten zu sparen und eine bessere Prognose zu erhalten, und vielleicht am wichtigsten, sinnvolle Leitlinien für die Behandlung von Arzneimittelresistenzen bei Patienten mit der T790M-Genmutation bereitzustellen.

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