Vývoj RISC týkající se PŘED členy

PŘED bílkovin rodina hraje ústřední roli v RISC-zprostředkované genové regulace. AGOs především zahrnovat čtyři charakteristické domény: N-terminální, PAZ (který je zodpovědný za malé RNA binding), Střední a C-terminální PIWI (které uděluje katalytické aktivity) domény (Doplňkové Fíky S1 a S2)18,19. Řada nekódujících RNA je jejich substráty, včetně Mirna, siRNA a RNA interagující s Piwi (Pirna)20. Malé RNA vedou AGOs ke svým specifickým cílům prostřednictvím komplementarity sekvence, což obvykle vede k umlčení cíle většinou post-transkripční inhibicí nebo degradací mRNA.

AGO2 a jeho homology byly identifikovány v Chordata, Arthropoda, Nematoda a Paraziti, a fylogenetický strom AGOs byla postavena (Obr. 1A a doplňkový obr. Galaxie). Podle své RNA-vazebných vlastností nebo funkcí, tyto AGOs byly rozděleny do tří tříd: (I) multifunkční AGOs; (II) siRNA-spojené AGOs; a (III) piRNA-spojené AGOs. AGOs třídy I obsahují akordát AGO1–4, ve kterém se všechny lidské AGOs spojují s siRNA i Mirna. Jak je znázorněno na obr. 1A, strunatce AGO1-4 obsahuje dvě podtřídy: AGO2 a AGO1/3/4. Pouze protein AGO2 funguje jako endonukleáza a štěpí mRNA v oblastech, které se báze spárují s dokonale komplementárními siRNA nebo Mirna. AGO1/3/4 jsou krájení-nekompetentní AGOs21,22 a odstranit osobní prameny přes bypass mechanismus. AGOs třídy II se specificky váží na siRNA, které obsahují Arthropoda (Drosophila AGO2) a Nematoda AGOs (TAG-76 / ERGO1 / WAGO1 / YQ53/NRDE3). AGOs v Arthropoda a Nematoda mají evoluční složitost ve srovnání s monofyletickou skupinou savčích AGOs (obr. 1A a doplňkový obr. Galaxie). Drosophila AGO2, jako součást komplexu RISC, je nutná pro odvíjení duplexu siRNA a následné sestavení siRNA do RISC v embryích Drosophila. Drosophila AGO2 sdílela úzký evoluční vztah s rostlinou / Chordata AGOs (Doplňkový obr. Galaxie). AGO1 je postradatelný pro efektivní RNAi u embryí drosophila23, ale v Uniprotu je nerecenzovaný a na obr. 1A. Fylogenetický strom a Pfam/SMART-domény struktury ukazují, že TAG-76 (Caenorhabditis elegans, C. elegans) má mírné podobnosti s savčích AGOs (Doplňkový Obr. S2). Bohužel jeho biologická funkce je stále nejasná, ale jiné nematodové proteiny se účastní dráhy RNAi. ERGO-1 slouží jako AGO a funguje v endogenní dráze Rnai24. WAGO1 je ČERVOVĚ specifický a umlčuje určité geny, transpozony, pseudogeny a kryptické loci25. Necharakterizovaný YQ53 s doménami PAZ a PIWI znázorněnými na doplňkovém obr. S2 má možnou funkci endogenní a exogenní RNAi18. Další jaderné PŘED bílkovin, NRDE3, se váže na sirna a je nutné pro jaderné RNAi, a tak transporty konkrétní třídy malých regulačních Rna do různých buněčných kompartmentů k regulaci genové expression26. III. třída AGOs jsou složeny z strunatce PIWIL1-4, Arthropoda AGO3/AUB/ PIWI/SIWI a Paraziti PIWIL/PIWI1/PIWI2. PIWIL1-4 členové PIWI rodiny, se váží na piRNAs a jsou výhradně vyjádřené v zárodečné linii buněk, ale i další AGOs jsou všude vyjádřené ve většině tissues27. Kromě toho Doplňkový obr. S3 ukazuje, že další Arthropoda AGO2-related proteiny jsou v blízkosti subclade z strunatce PIWIL1-4, a jsou v režii piRNAs štěpit transposon přepisy a poučit Piwi potlačit transposon přepis na ochranu germline genome v Drosophila ovariální zárodečné buňky. Členové PIWI proteinů rodiny (PIWIL, PIWI1 a PIWI2) byly identifikovány také v Paraziti (Dugesia japonica a Schmidtea mediterranea). Mají domény podobné doménám živočišných AGOs a mohou být vyžadovány pro funkci kmenových buněk a biogenezi piRNA (doplňkové obr. S2 a S3)28,29.

předchozí studie určily tři skupiny AGOs v rostlinách30. Například Arabidopsis thaliana (A. thaliana) vykazuje stejné rozdělení jeho deseti členů do tří skupin: (I) AGO1, AGO5, AGO10; (II) AGO2, AGO3, AGO7; a (III) AGO4, AGO6, AGO8, AGO9. V souladu s těmito výsledky naší analýzy ukázaly, tří hlavních skupin, a tyto rostliny AGOs byly uměle rozděleny do tří tříd na základě jejich funkce: (I) multifunkční AGOs; (II) siRNA-spojené AGOs; a (III) doplňkové fungování AGOs. Skóre výbuchu založené na identitě proteinové sekvence však neposkytují přesnější klasifikace (obr. 1A a doplňkový obr. Galaxie). Třída I AGOs jsou AGO1/AGO5/AGO10 (A. thaliana) a AGO1A/AGO1B/AGO1C/AGO1D/AGO11/AGO12/AGO13/AGO14/AGO17/AGO18/PNH1/MEL1 (Oryza sativa, O. sativa). AGO1 akty v miRNA a siRNA dráhy, a AGO10 případně se účastní těchto cest, alespoň v některých tkáních; AGO5, lokalizované v jádře a cytoplazmě, se váže na malé Rna a reguluje RNA zprostředkované post-transkripční genové silencing31. PNH1 (o. sativa) pravděpodobně ovlivňuje tvorbu střílet apikální meristém a listy buněk adaxiální specifikace a RNA umlčování pathway32,33. MEL1 pravděpodobně zprostředkovává malé umlčení genů souvisejících s RNA a jeho funkce může být provedena jiným AGO v Arabidopsis33. Ago třídy II obsahují AGO2/AGO3/AGO7 (a. thaliana) a AGO2/AGO3/AGO7(o.sativa). AGO7 působí v rdr6/SGS3/DCL4 / AGO7 trans-působící cestě siRNA, která se podílí na načasování vývoje listů. AGO2 / 3 postrádají motiv DDH v doméně PIWI a pravděpodobně mají podobné aktivity; a mutanti AGO2 / AGO3 nevykazují žádné vývojové vady. AGOs třídy III obsahují AGO4 / AGO6 / AGO8 / AGO9 (a. thaliana) a AGO4A/AGO4B/AGO15/AGO16 (o.sativa). Tyto AGOs mají doplňkové biologické funkce. AGO4 je možná sdílena v různých jaderných komplexech a odlišnou cestou34. AGO6 je vyžadován pro heterochromatinovou siRNA a transkripční cesty tlumení genů a aktivita AGO6 je částečně redundantní s aktivitou AGO4. Ago8 / 9 (a. thaliana) mRNA mají odlišnou distribuci tkání a jejich mutanty nemají žádný vliv na fenotypy rostlin. Na základě sekvenčních identit existuje jasná skupina členů třídy I (oranžová), ale existuje překrývající se oblast mezi členy třídy II (zelená) a členy třídy III (tmavě zelená) (obr. 1A). AtAGOs byl studován po celá desetiletí, ale mnoho otázek stále zůstává. Zdá se, že OsAGOs mají vyšší diverzity a duplikace genů, protože bylo identifikováno mnoho izoforem, jak je znázorněno na obr. 1A a doplňkový obr. Galaxie.

jeden DÁVNO obsahující PIWI domény je identifikován v Této Giardia intestinalis (Giardia lamblia) genomu a reguluje varianta-specifických povrchových bílkovin (VSP) výraz na povrchu každého parazita prostřednictvím RNAi dráhy (Doplňkové Fíky S2 a S3)35. Překvapivě, jediný AGO1 s Paz a Piwi doménami z kvasinek byl nalezen v houbách a těsně umístěn na třetím kladu rostlin (doplňkové fíky S2 a S3). Může mít sekvenčně specifickou aktivitu vazby DNA, a jeho Podrobná role v RISC by mohla být podrobně prozkoumána.

vývoj členů Dicer souvisejících s RISC

proces RNAi vzniká interakcí mezi molekulami RNA a RISC. Dicer ukotvuje molekulu dsRNA a řeže ji za vzniku krátkých dsRNA jako primárního enzymu pro rozpoznávání a zpracování RNA v procesu RNAi. Dicer je členem rodiny RNase III a vysoce konzervovaný ve vývoji. Sekvenční analýzy ukazují, že Dicer každého druhu má podobné domény. U většiny druhů je N-konec Dicer doménou RNA helikázy následovanou doménou PAZ (Doplňkový obr. S1). C-konec Dicer má dvě domény RNÁZY III a doménu vázající dsrna36.

Dicery jsou v eukaryotách velmi rozšířené. Současný fylogenetický strom rodiny DICERŮ ukazuje svou nezávislou diverzifikaci u zvířat ,rostlin a hub (obr. 1B a doplňkový obr. S4). Odlišné s fylogenetický strom zvíře AGOs, monophyletic skupiny zvířat DICER bylo zjištěno, že patří Chordata, Arthropoda a Nematoda a jedna třída byla funkčně generované: multifunkční DICERs. Tyto Dicery mají dvojí funkci rozpoznávání vlásenky nebo dsRNA a jejich zpracování do zralých duplexů miRNA-miRNA*/siRNA. Je pozoruhodné, že Arthropoda DICER (Drosophila DCR1), je nutné pro miRNA biogeneze, a nezařazených Drosophila DICER paralogue DCR2 v UniProt může být pro tvorbu sirna. Helikázové motivy Nematoda DICER (C.elegans DCR1) jsou vyžadovány pro siRNA, ale ne miRNA, zpracování37,38,39,40. Dicer potřebný pro zpracování Pirny zůstává neidentifikován. Další konstruovaná podtřída chordate zahrnuje DDX58, DHX58, IFIH1, FANCM a RNC (obr. 1B a doplňkový obr. S4). Všichni mají helikázové aktivity, ale DDX58 a DHX58 se váží na DNA a IFIH1 a FANCM mají vazby na RNA. Funkčně se mohou účastnit komplexů podobných RISC a reagovat na exogenní stres. RNC kóduje dsRNA-specifickou Rnázu III.

v rostlinách jsou čtyři Dicery (DCL1-4) 38. Doplňkový Obr. S4 ukazuje monofyletickou skupinu rostlinných Dicerů obsahujících čtyři podklady: DCL1, DCL2, DCL3 a DCL4. Na základě typů zrání malých RNA rostlin byly tyto Dicery seskupeny do dvou tříd: (I) multifunkční Dicery (DCL1); a (II) Sirna-asociované Dicery (DCL2-4). DCL1 se podílí na tvorbě RISC pro zpracování prekurzorů miRNA / siRNA. AtDCL2-4 generují siRNA a podílejí se na obraně virů a produkci siRNA z přirozených CIS-působících antisense transkriptů, vedení modifikace chromatinu nebo regulace změny vegetativní fáze39,40,41. RTL3 (o. sativa) patří do podtřídy DCL1 a rodiny RNÁZY III, což naznačuje, že pravděpodobně zahrnuje cestu miRNA / siRNA. Dále, více DICER izoformy byly nalezeny v O. sativa, což naznačuje, že k duplikaci genů mohlo dojít během vývoje Rice DICER. Rostlina clade vyhledá v outgroup, včetně RTL3 (A. thaliana) a RTL2 (A. thaliana a O. sativa), které jsou ribonucleases štěpí dsRNA a produkci malých Rna.

Houby (Ascomycota) Dicers ukazují dva subclades podporován bootstrap hodnoty 64: (I) DCL1, DCR1(Schizosaccharomyces pombe, S. pombe); a (II) DCL2 (Obr. 1B a doplňkový obr. S4). Ve vegetativní buňky, DCL2 je hlavní Dicer enzymu v procesu biogeneze siRNA, ale DCL1 má redundantní role42. Avšak pouze DCL1 je specificky exprimován a vyžadován pro meiotické umlčení během meiózy43. V procesu zrání siRNA jsou prekurzory dsRNA zpracovávány DCR1 s podobnými doménami kanonického DICERU u zvířat. DCR1 (s. pombe) je Dicerův homolog ve štěpných kvasinkách. MPH1 je ATP-dependentní DNA helikáza spojená s odpovědí na poškození DNA k udržení integrity genomu44. Kvasinky MFH2 mají vazbu na DNA a aktivitu DNA helikázy. Další clades jsou hlavně z bakteriální RNCs (Actinobacteria, Aquificae, Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes a Thermotogae), které kódují RNase a štěpí Rna (Obr. 1B a doplňkový obr. S4).

Vývoj RISC-související TRBP a PAKT členy

TRBP je zapleten v HIV-1 genu expression45, případně propojení miRNAs a odpovědi IFN-PKR cestu k HIV-1 infection46. U obratlovců je TRBP paralogem k proteinu aktivujícímu protein kinázu R (PKR) nebo PACT46,47. Regulují PKR jako inhibitor (TRBP) nebo aktivátor (Pakt). Biologické funkce TRBP a/nebo Paktu související s RISC se třemi doménami DRSM (které se vážou na dsRNA a zprostředkovávají interakci protein-protein), znázorněné na doplňkovém obr. S2, jsou následující: rekrutování substrátů pro Dicer, usnadnění Dicer-zprostředkované zpracování nezralých miRNAs, odstranění Dicer produktu a řízení, který typ dsRNA je načten do AGOs12,13.

v našich fylogenetických stromech jsou TRBPs / pakty zobrazeny pouze v Chordatách (obr. 1C, D a doplňkové obr. S5 a S6). Jinak Drosophila R2D2 A C. elegans RDE-4, jak známo, účastníci RNAi zpracování, jsou vzdáleně příbuzné TRBP/PAKT a ne objevit v strunatce clades z TRBP/PAKT. Upovídaný byl zjištěn u hmyzu, ale nejsou považovány za, protože nízké sekvenční identity a nezařazených vstupu v UniProt (Obr. 1C, D). Další evolučně související RNA/DNA vazba geny jsou DSRAD (Chordata), STAU1/2/STAUH (Chordata, Měkkýši a Členovci), ILF3 (Chordata), STRBP (Chordata), RED1/2 (Chordata) a RNC (Chloroflexi a Proteobacteria). DSRADs se podílejí na editaci RNA a usnadňují načítání miRNA na RISC48. Strunatce STAU1/2/STAUH se zdá fungovat v mRNA dopravy nebo distribution49,50, a podobné prekurzory miRNA, Exportin-5 transportů Staufen-dsRNA komplexy z nucleus51. Chordát ILF3 se váže na RNA a funguje v biogenezi kruhových RNA (cirkrna). Chordate STRBP reguluje spermatogenezi a funkci spermií vazbou dsDNA / RNA. Chordát RED1 katalyzuje úpravu A-to-I RNA, aby ovlivnil expresi a funkci genu. Strunatce RED2 s adenosin deaminázy činnosti a dsRNA/ssRNA vazebné afinity zabraňuje vázání další ADAR enzymy cílů a snižuje účinnost těchto enzymů. RNC v Chloroflexi a Proteobakteriích patří do rodiny RNÁZY III. Nečekaně, DRB2 (O. sativa) a IIV6-340R (Bezobratlých duhové virus 6) byly umístěny na clades z strunatce DSRAD a bakteriální RNCs v naší fylogenetický strom z PAKTU, respektive (Obr. 1D a doplňkový obr. S6). Mohou se vázat a štěpit RNA v rostlinách nebo jejich hostiteli, ale jejich funkce související s RISC jsou stále neznámé.

Vývoj RISC-související GW182 členy

GW182 zjištěných u zvířat je klíčovou součástí RISC, spolupracuje PIWI domény z AGO1 prostřednictvím své N-terminální region pro miRNA-mediated gene nařízení (Doplňkový Obr. S1) a vykazuje vysoké rozdíly v délce sekvence, konzervaci a složení. V této studii byly pro spolehlivou fylogenetickou rekonstrukci použity plné délky sekvencí GW182 a jeho ortologů ,což bylo v souladu s předchozími výsledky (Doplňkový obr. S7) 17. Výsledky ukazují, že savců TNRC6C je zakládajícím členem strunatce genové rodiny zastupování a odlišné od orthologue z nonchordate GW182 geny.

v naší studii byl identifikován a charakterizován omezený počet GW182, včetně člověka, myši a mouchy (obr. 1E a doplňkový obr. S7). Další databáze BLAST vyhledávání, analýza GW182 mRNA/proteinu ukázala, žádné další homology s vysoce přesvědčen, sekvence, podobnosti a biologické funkce, a to i v Nematoda. Místo toho jsou v genomu C.elegans kódovány dva funkční analogy, AIN-1 a AIN-2. Pozorování není překvapivé, protože více než polovina genů kódovaných v nematodě je jedinečná52.

genová duplikace analýza hlavních členů RISC

genová duplikace je klíčovou hnací silou diverzity fenotypu, příčiny lidských chorob a evoluce. V naší studii jsme kvantifikovali události genové duplikace hlavních členů RISC. Ve stromu AGOs bylo identifikováno 51 genových duplikací (Doplňkový obr. S8). Třídy I, II a III Agos zvířat obsahovaly 6, 4 a 14 genových duplikací. Třídy I, II a III rostlinných AGOs zahrnovaly 13, 3 a 5 genových duplikací. Ve stromu Dicerů bylo stanoveno 61 duplikací genů (Doplňkový obr. S9). Z této třídy zvířecích Dicerů vznikly 4 genové duplikace z Chordata. Ve dvou třídách rostlinných Dicerů měla pouze třída II 6 genových duplikací. Pro TRBP / Pakt / GW182 existovaly 68/27/10 genové duplikace, ve kterých byl počet jejich úzce souvisejících genových duplikací 1, 3 a 2 (doplňkové obr. 10-12). Tyto výsledky naznačují, že spousta duplikací genů v AGOs a DICERs může být hlavním přispěvatelem k evoluční rozmanitosti.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.